293細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用

是腺病毒載體的包裝細(xì)胞。腺病毒是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒后用于基因治療研究的熱門載體。直接將腺病毒載體導(dǎo)入人體內(nèi)表達(dá)目的基因，治療惡性腫瘤，心血管疾病或一些遺傳疾病已取得可喜進(jìn)展；利用腺病毒載體在包裝細(xì)胞 293中表達(dá)分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸激酶 1C等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的一條途徑。因此完善 293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)具有越來越重要的市場意義。哺乳細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方式有三種：貼壁培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)，無血清懸浮培養(yǎng)。這三種方式均可用于 293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。

293細(xì)胞特性

293細(xì)胞是用5型腺病毒75株系轉(zhuǎn)化，含有Ad5 E1區(qū)的人胚腎細(xì)胞。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建而成。293細(xì)胞是貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，表現(xiàn)出典型的腺病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的表型，細(xì)胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293細(xì)胞為人亞三倍體細(xì)胞系。293細(xì)胞在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養(yǎng)基中。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。與傳統(tǒng)靜止單層培養(yǎng)相比，轉(zhuǎn)瓶具有三大優(yōu)點(diǎn)：為細(xì)胞提供較大的生長表面；輕微的轉(zhuǎn)動可以防止培養(yǎng)液中形成的某些成分對細(xì)胞生長可能產(chǎn)生的影響；細(xì)胞大部分時間僅覆蓋一薄層培養(yǎng)液，有利于氣體交換。我們已成功實(shí)現(xiàn)293細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。由于293細(xì)胞對生長環(huán)境的改變較為敏感，細(xì)胞容易成團(tuán)，因此維持穩(wěn)定的溫度，酸堿度和轉(zhuǎn)動速度對細(xì)胞正常均勻生長至關(guān)重要?，F(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩部分。293細(xì)胞接種后，維持適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速培養(yǎng)。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)速略有不同。細(xì)胞的均勻分散貼壁情況與培養(yǎng)液溫度，瓶子的轉(zhuǎn)動速度和細(xì)胞特性有關(guān)。在5-6天的培養(yǎng)周期中，細(xì)胞量可增殖20倍。

反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)

此種培養(yǎng)方式中，細(xì)胞貼附于固定的表面生長，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品；但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長情況，故多用于制備用量較小，價值高的生物藥品。 CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器，用于細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)時可使用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米的無紡聚酯纖維圓片，具有很高的表面積與體積比(1200cm2/g)，有利于獲得高細(xì)胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細(xì)胞培養(yǎng)使用最多的方式，除用于293細(xì)胞的培養(yǎng)外，還用于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，Hela細(xì)胞培養(yǎng)，CHO細(xì)胞培養(yǎng)及其它細(xì)胞培養(yǎng)。此種方式培養(yǎng)293細(xì)胞，細(xì)胞接種后貼壁快，接種1小時后細(xì)胞貼壁率可達(dá)98%以上，采用灌流培養(yǎng)。整個培養(yǎng)周期約7-10天，細(xì)胞增殖25-50倍。

微載體培養(yǎng)

微載體是目前最有發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞，成肌細(xì)胞，Ve r o細(xì)胞，CHO細(xì)胞。常用商品化微載體有三種：Cytodex ，Cytopore和Cytoline。 使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT B反應(yīng)器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。微載體培養(yǎng)293細(xì)胞，首先要選擇合適的微載體類型和攪拌速度。接種細(xì)胞可用1L spinner微載體培養(yǎng)系統(tǒng)或是其它貼壁培養(yǎng)方式準(zhǔn)備，采用灌流培養(yǎng)，培養(yǎng)周期10-15天，能達(dá)到的細(xì)胞密度為5-10×106/ml。

無血清懸浮培養(yǎng)無血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的研究新方向。要實(shí)現(xiàn)293細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)必須先將貼壁培養(yǎng)293改造為懸浮培養(yǎng)293S細(xì)胞并尋找適合高密度無血清培養(yǎng)的培養(yǎng)液配方。懸浮培養(yǎng)時，由于缺少血清和蛋白的保護(hù)作用，293S對剪切力的敏感度增加，難以達(dá)到高密度培養(yǎng)，導(dǎo)致293S產(chǎn)生病毒的數(shù)量比貼壁培養(yǎng)低5-10倍左右。細(xì)胞接種后，灌流培養(yǎng)7天，達(dá)到細(xì)胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。